École de Fontainebleau, portrait présumé de Gabrielle d'Estrées et de sa sœur, la duchesse de Villars , ca. 1594, auteur inconnu
Gabrielle d'Estrée meurt le 10 avril 1599 à l'Hôtel de Sourdis, rue Perrault, à vingt-six ans. Elle était enceinte de son quatrième enfant d'Henri IV. Leur mariage était prévu pour la semaine suivante — le roi venait d'obtenir l'annulation de son union avec Marguerite de Valois.
La mort est soudaine et terrible. Après un dîner chez un financier florentin, Sébastien Zamet, elle est prise de convulsions violentes. Elle agonise plusieurs jours, défigurée, méconnaissable. Le diagnostic officiel est l'éclampsie — une complication grave de la grossesse. Mais le bruit court aussitôt qu'elle a été empoisonnée, peut-être par une orange offerte lors du dîner. Les suspects ne manquent pas : les ennemis d'Henri IV, les partisans du duc de Guise, les agents de Marie de Médicis qu'on s'apprête à lui faire épouser à la place.
L'affaire n'a jamais été élucidée. Les historiens penchent aujourd'hui pour l'éclampsie, mais le doute subsiste. Ce qui est certain, c'est que sa mort arrangeait beaucoup de monde.
Henri IV fut anéanti. Il écrivit à Gabrielle les plus belles lettres d'amour de son règne, et la porta en deuil plusieurs semaines — ce qui était extraordinaire pour un roi de France. Six mois plus tard, il épousait Marie de Médicis.
Gabrielle d'Estrée est immortalisée par un tableau célèbre conservé au Louvre — deux femmes nues dans un bain, l'une pinçant le sein de l'autre, allusion à sa grossesse royale. Son identité exacte dans ce portrait reste discutée.